Pikk tee uuringuideest avaldatud artiklini – kadalipp või seiklus?

2017. aastal kirjutasin siinsamas blogis katsest, mille viisime läbi Kakrarahu kalakajakatega. Katse eesmärgiks oli uurida, kas vanemate vanus mõjutab tibude telomeeride (DNA ahelate otstes olevate kaitsvate “mütside”) pikkust. Täpsemalt, varasematest uuringutest oli teada, et vanemate lindude poegade telomeerid kipuvad olema lühemad kui nooremate lindude poegadel, aga polnud teada, kas see mõju tuleneb koorumise eelsetest teguritest (nt sugurakkude telomeeride pikkus) või koorumise järgsetest teguritest (erinev hoolitsuse kvaliteet vanade ja noorte vanemate poegadel).

Telomeeride pikkus on oluline, sest mõjutab vananemise kiirust. Telomeerid lühenevad iga rakujagunemisega. Kui telomeerid liiga kiiresti lühenevad, siis ei saa rakud mingist hetkest enam uueneda ja koed ennast parandada. Kuna on teada, et vanade kajakate poegadel on pisut väiksem tõenäosus suureks kasvada, võimaldas see katse testida, kas vanema vanuse mõju poegade tervisele vahendavad telomeerid.

Et seda teada saada, korraldasime suurejoonelise „ristlapsendamise“ katse, kus tõstsime kajakamune vanade vanemate pesadest noorte vanemate pesadesse ja vastupidi. Mis oli meie uuringu tulemuseks? Vanemate vanus ei mõjutanud telomeeride pikkust mitte kuidagi. Telomeerid olid sama pikad noorte ja vanade vanemate tibudel, ning meie uuringuperioodi vältel (kaks nädalat peale koorumist) ei erinenud telomeeride lühenemise kiirus noorte ega vanade pesades kasvanud tibudel. Kahe sõnaga – negatiivsed tulemused. Väärtuslik teaduslik teadmine, kuid kahtlemata vähem atraktiivsed ja raskemini publitseeritavad kui positiivsed tulemused, püstitatud hüpoteesi suurejooneline tõestamine.

• 

Negatiivsetest tulemustest on aga veelgi raskemini avaldatavaid asju. Ja selleks on üldteadmistele vastukäivad tulemused. Kõik „teavad“, et telomeerid lühenevad vanuse suurenedes. Mis juhtus aga meie tibudel? Nende telomeerid muutusid kahe nädala jooksul peale koorumist hoopis pikemaks! Mis toimub? Kajakad muutuvad kasvades füsioloogiliselt nooremaks! Telomeeride pikenemine on loomulikult põhimõtteliselt võimalik, seda korraldab ensüüm telomeraas. Siiski oli telomeeride pikenemist vanuse kasvades näidatud meie analüüside valimise ajaks vaid loetud arvul liikidel (nüüdseks on siiski üha uusi sellekohaseid tulemusi tulnud).

Selle postitusega tahtsin aga kajakate rakubioloogia saladuste asemel juhatada lugeja käima mööda teadusuuringu teekonna käänulist rada. See lugu algas tegelikult juba ammu enne 2017. aastat, kui leedu tüdruk Kristina Noreikiene kirjutas taotluse järeldoktorantuuri tulekuks Peeter Hõraku töörühma. Tema taotluses oli see katse idee kenasti kirjeldatud, kuid rahastust tema projekt ei saanud. Kristina liikus edasi muudele põnevatele teadusradadele, uurima eelajalooliste inimeste DNAd ja hiljem kalade stressi, kuid mul oli kahju head katseideed raisku lasta ja Kristinaga kokkuleppel asusin seda ise läbi viima.

Katse läbiviimist Matsalu kalakajakakoloonias raskendas siiski üks pisiasi – ma olin 2017. aasta suvel USAs, järeldoktorantuuris Arizona kõrbes lindude linnastumist uurimas. Niisiis tuli katse korraldamiseks paluda hulga heade kolleegide abi. Põhitöö tegid ära Maaülikooli teadlane Kalev Rattiste ja minu tolleaegne doktorant Janek Urvik. Laiul käisid tibusid taga ajamas abiks aga ka Lauri Saks ja Richard Meitern, nõu ja jõuga toetas Peeter Hõrak. Kuuldavasti oli kõvasti pusimist. Kajakatibud on teatavasti pesahülgajad, ning neid kaks nädalat peale koorumist kordusproovi võtmiseks kätte saada oli paras väljakutse.

Juuni keskpaigaks olid siiski proovid kenasti purgis. Kas võis kergemalt ohata? Oh ei! Siit on veel väga pikk tee minna. Otsustasime proove analüüsida telomeeride eksperdi Britt Heidingeri laboris, aga see asus Matsalust õige kaugel – Põhja-Dakota osariigis USAs. Algatuseks tuli proovid saata Arizonasse, et mina oma katsega lõpuks kokku saaksin. Külmutatud koeproovide saatmine üle ookeani pole aga sugugi naljategu. Esiteks tuleb olla kindel, et need üles ei sula. Teiseks tuleb paberid väga hoolega korda ajada, et proovid tolli kinni ei jääks.

Meil läks seekord halvasti – load olid küll olemas, kuid mingi paber oli puudu (täpsemalt oli puudu Migratory bird permit, luba rändlindude ja nendega seotud materjalide üle piiride liigutamiseks USA Kalandus- ja metsloomaametilt. Oleksime me paigalinde uurinud, oleks see jama olemata jäänud…), ja see avastati alles siis, kui proovid USA tollis olid. Mul läks vajalike paberite kordaajamiseks aega mitu nädalat (USAs saadetakse dokumente endiselt ümbrikuga…), kuid õnneks olime valinud väga kalli ja kvaliteetse kullerfirma, mis nende nädalate jooksul proovidel üles sulada ei lasknud. 2017. aasta talveks olid proovid seega lõpuks õnnelikult Arizonas külmikus.

Arizonasse saabus 2018. aasta kevadeks ka doktorant Janek Urvik, kellega koos pisikese kõrvalprojektina sama pakiga tulnud munaproovidest uurisime, kas vanade ja noorte kajakate munades on erinevas koguses kasulikke aineid karotenoide. Oli tõesti vanade lindude munades vähem, ja sellest tuli ka kena teadusartikkel.

Telomeeride uurimiseks sõitsin aga maikuus, napilt enne oma järeldoktorantuuri lõppu, koos teise sama labori järeldoktorandi Mathieu Giraudeauga Põhja-Dakotasse, Fargo linna. Britt Heidingeri ja tema geniaalse laborijuhata Jeffrey Kittilsoni juhendamisel õppisime selgeks qPCR-i metoodika telomeeride mõõtmiseks. Pean ütlema, et Jeffi meetodid meenutasid vägagi Harry Potteri nõiajookide tunde: „Võta tuub prooviga kummikinnastatud kätte. Sega pipetiotsikuga täpselt 40 korda. Siis keera tuubi põhja üles 20 korda. Siis seisa pea peal, tee kolm tiiru vastupäeva ja löö vasaku jala kannaga vastu maad.“ Hea küll, seda viimast polnud, kuid detailid, detailid, detailid, olid üliolulised, ja tõepoolest, mida täpsemalt me neid juhiseid järgisime, seda suurem oli mõõtmistäpsus.

Nädala lõpuks olid proovid mõõdetud ja tulemused üldjoontes teada. Lõplikud statistilised analüüsid viisime läbi aga koos Peeter Hõraku ja Richard Meiterniga juba siis, kui tagasi Eestis olin. 2018. aasta sügis-talvel sain algust teha artikli kirjutamisega. 2019. aasta kevadel oli käsikiri valmis esitamiseks.

Kuna tegemist oli intrigeeriva teemaga ja korrektselt läbi viidud eksperimentaalse uuringuga, katsetasime alustuseks ajakirja Scientific Reports, mis kuulub teadusmaailma tippajakirja Nature „perekonda“. Töövõiduks oli juba retsenseerimisele pääsemine – palju käsikirju saadetakse tagasi toimetaja otsusega enne retsenseerimisele saatmist. See osutus siiski Pyrrhose võiduks. Retsensentidel oli käiskirjale palju etteheiteid, peamiselt siiski see, et „Miks teie tibudel telomeerid pikenesid? Telomeerid peavad ju lühenema!“ Tavateadmistele vastu minevaid teadustulemusi on oluliselt keerulisem avaldada kui nendega kokku langevaid, ning sa pead tegema ära sada imet tõestamaks, et su meetodid olid adekvaatsed ja tegemist pole valetulemuse ehk artefaktiga.

Pärast seda, kui olime kolme retsensiooniringiga lisanud käsikirjale umbes 20 leheküljese lisafaili jagu toetavaid analüüse ning oma sissejuhatuse ja arutelu kolm korda ümber kirjutanud, saabus lõppotsus – „rejected!“, tagasi lükatud. Selleks ajaks oli juba kätte jõudmas aasta 2020. Eitava otsuse saabumise hetkel viibisin ise haiglas, olles eelmisel õhtul ilmale toonud enda „pesapoja“.  Hoolimata tohutust tööst, mis ma sellesse artiklisse ja nendesse ümberkirjutamistesse pannud olin, oli sel hetkel ausalt öeldes tunne, et mul on täiesti ükskõik.

2020. aasta oli käes ja käsikiri seisis sahtlis. Teadsin küll, et tuleks see uuesti esitada kuhugi ajakirja, kuid motivatsioon oli madal ja aega-energiat nappis. Kaasautor Britt Heidinger oli veendunud, et avaldatud saamiseks peame käsikirja uuesti ümber kirjutama ja peitma tulemustest peaaegu täielikult ära telomeeride pikenemise. Lõppversiooni jäigi see sisse vaid ühe lausena tulemuste alapeatükis ja paarilauselise mainimisena arutelus. Ennast kokku võtta käsikirja ümberkirjutamiseks suutsin alles 2020. aasta sügisel.

Uueks sihtajakirjaks sai Molecular Ecology, kus oli ilmumas telomeeride teemaline erinumber. Kuigi tegemist polnud Nature-perekonna ajakirjaga, on see siiski väga soliidne teadusajakiri, mille kvaliteedinäitaja ehk mõjutegur (impact factor) on isegi kõrgem (IF 5,2) kui meid 2019. aastal kõvasti solgutanud Scientific Reports-il (IF 4). Mathieu võttis ühendust erinumbri toimetajaga ning too oli meie käsikirjast kohe huvitatud. Ilmselt ei tulnud kahjuks ka tõsiasi, et Mathieu oli toimetajaga koos kunagi Austraalias sisalikke uurinud. Tutvused on teadusmaailmas olulised, kuigi artikli avaldamine sõltub siiski eelkõige (anonüümsete) retsensentide arvamusest.

Edasi läks seni üle kivide ja kändude kulgenud teekond libedalt. Käsikiri läks toimetusest edasi retsensentidele, kes soovitasid sellele küll omajagu parandusi, kuid nende sisseviimise järel tuli kauaoodatud kiri „Manuscript accepted!“. 2021. aasta aprillikuu tähistab selle pika teekonna lõppu. Kõik, kes selle artikli valmimisse panustasid, saavad oma teaduslikku CVsse lisada ühe rea. Ja maailm on jälle ühe teadmise võrra rikkam.

See pikk teekond algas leedu tüdruku ideest, sai tuule tiibadesse kevadises Matsalus, jõudis läbi raskuste Arizonasse ja sealt Põhja-Dakotasse, tegi minuga kaasa mu järeldoktorantuuri ja sellejärgsed aastad Eestis, ning lõpuks saan sellele loole punkti panna. Kas see tulemus oli seda kõike väärt? Ei oska öelda. Artikkel ilmus heas ajakirjas. Olen kindel, et see leiab palju lugejaid ja viitamisi, sest põlvkonda-ülesed mõjud DNA-le on endiselt väga oluline ja teaduslikus mõttes „kuum“ teema, ja vaba looduse eksperimente ei tehta sel teemal just palju (tuletage meelde tibupüüdmist laiul – see on raske!). Samas on see lõpuks minu jaoks ikka vaid üks publikatsioon paljudest, ning töötunde, mis ma (ja ka teised autorid) selle uurimuse alla pannud olen, on pehmelt öeldes terve koormatäis.

Teadusartikli ilmumine on kahtlemata alati selle alla läinud töö nähtav jäämäe tipp. Mõnikord on see vee alla jääv osa pisut väiksem, mõnikord nii hiiglaslik, et võiks ulatuda ookeani põhjani. Tihtipeale on ette raske ennustada, kui suur töö on uuringu ideest artikli avaldamiseni jõudmine. Kui ma juba aga sellele teele astunud olen, siis peatuda ma enam ei taha, ja puhtast inertsist lähen varem või hiljem siiski lõpuni välja. On tore asju lõpetada, eriti selliseid, kuhu paljud tublid ja targad inimesed nii palju tööd sisse on pannud. Lõpp hea, kõik hea, „tantsige ja jooge viina“, nagu mu juhendaja doktorantuuri ajal artiklite avaldamisteate järel oma töörühmale ikka kirjutas. See kadalipp (või siis seiklus) on taaskord läbitud.

Artikli viide: Tuul Sepp, Richard Meitern, Britt Heidinger, Kristina Noreikiene, Kalev Rattiste, Peeter Hõrak, Lauri Saks, Jeffrey Kittilson, Janek Urvik, Mathieu Giraudeau. 2021. Parental age does not influence offspring telomeres during early life in common gulls (Larus canus). Molecular Ecology, ilmumas.